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          HPLC法测定谷物中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

          点击次数:10191 发布时间:2011/9/22
          提 供 商: 广州艾欣科学仪器有限公司 资料大?。?/td>
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          HPLC法测定谷物中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

           

             

               用一种快速方便的 真菌毒素多功能净化柱处理样品,然后用液相色谱对谷物中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2进行测定。样品经乙腈-体积比8416)提取,提取液通过真菌毒素多功能净化柱净化、浓缩,三氟乙酸(TFA)柱前衍生快三平台官网,C18色谱柱分离,荧光检测器检测,外标法定量。对添加两个浓度黄曲霉毒素的玉米样品进行加标回收实验,4种毒素的回收率均在90.44%101.23%之间,B1快三平台官网快三平台官网、G1、B2快三平台官网、G2的zui低检测限分别为2.0、1.0、0.5快三平台官网快三平台官网、0.5ng/kg。实验结果表明,此法不仅定量准确快三平台官网,精密度高而且操作极为方便。

              

           

          真菌毒素对粮食饲料的污染是一个全球性的问题,我国因是农业大国和人民以谷物为主食的饮食习惯,使真菌毒素的污染问题显得更为突出?;魄苟舅厥钦婢舅氐闹匾碇?,对世界上30多个国家和地区进行的调查表明,危害程度排在*位的是黄曲霉毒素。它是由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的一组结构类似的化合物[1],均为二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。虽然黄典霉毒素(AF)的衍生物有20多种快三平台官网,目前已分离鉴定出的AF包括:AFB1、AFB2、AFG1快三平台官网、AFG2快三平台官网、AFM1快三平台官网、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12种快三平台官网,但天然污染粮油食品的AFB组和G组两大类,即AFB1、AFB2、AFG1AFG2?;魄苟舅氐亩拘?,致突变及致癌作用已得到明确证实。它由强到弱的顺序依次为AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。 欧盟的黄曲霉毒素的限量标准AFB14μg/kg。

              霉菌毒素的检测定量一直是个难点,目前黄曲霉毒素检测的国标方法有薄层色谱法、酶联免疫法、免疫亲和柱净化液相色谱法快三平台官网。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差快三平台官网、耗时长;而酶联免疫法虽操作简单快三平台官网、灵敏度高,但特异性差;免疫亲和柱液相色谱法是柱后衍生法,它对于高黄曲霉毒素含量的样品偏差较大。且柱后衍生不普及,给使用带来不便。本文所述方法用真菌毒素多功能净化柱快速净化,液相柱前衍生法简单方便快三平台官网,灵敏度和特异性高快三平台官网,又能避免氯仿等有毒试剂的使用,是一种值得推广的好方法快三平台官网。这种方法,在国际上不少试验室已得到确认,还被作为AOAC的方法。

          1 材料与方法

          1.1 试剂和仪器

              乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、叠氮化钠(分析纯)、去离子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能净化柱、液相色谱仪、2475荧光检测器。

          1.2 标准品的准备

              标准品包括了黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2各单一标准液和混合标准液,溶剂为乙腈,黄曲霉素混合标准液的浓度为2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。单一标准液用来确定各自的保留时间快三平台官网,具体工作用混合标准液是将所提供标准液稀释10倍,用微量注射器分别取5.0、10.0、20.0快三平台官网、25.0、40.0、50.0μl稀释标准液具体浓度为200ng/mlB1、G1快三平台官网;50ng/mlB2快三平台官网、G2),和样品一样蒸干,用三氟乙酸衍生,定容于0.2ml流动相,故所得进针的浓度分别是:B1、G15.0快三平台官网、10.0、20.0、25.0快三平台官网、40.0快三平台官网、50.0ng/ml;G2、B21.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。

          1.3 样品

              实验所用样品包括玉米、小麦等,取代表样品5kg,粉碎,充分混合均匀,四分法缩至500g。因霉菌毒素分布不均匀,充分混合非常重要快三平台官网,必要时取样量加大(有地方建议取15kg)。

          1.4 样品的提取和净化

              使用粉碎机将样品研细,称取25g研细样品置于250ml的烧瓶或搅拌瓶中。加入100ml乙腈-水(体积比8416)溶液。在旋转震荡器上震荡1h。用漏斗、定性滤纸将其过滤到样品瓶中快三平台官网。转移8ml样品提取液通过PuriToxSR160 菌毒素多功能净化柱,推出大约4ml的净化液(具体过程见图1),转移2ml已净化的提取液至洁净的棕色瓶 。在水浴60℃条件下用氮气吹干。

           

          1.5 柱前衍生及液相色谱条件

              向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸,立即旋紧盖子。涡旋30s快三平台官网,在40℃烘箱中衍生15min,室温下氮气吹干混合物,用200μl-乙腈(体积比8515)溶解残余物并涡旋30s,将其转移到1.5ml的离心试管中以10 000r/min的速度离心5min,把已经制备净化好的150μl样品液转移到HPLC样品瓶,进样25μl快三平台官网。液相色谱条件见表1。

           2 结果与讨论

          2.1 4种黄曲霉毒素的分离情况

              50μl黄曲霉毒素混标工作溶液浓度为B1快三平台官网、G1 200ng/ml;G2、B2 50ng/ml)于棕色瓶内,吹干,衍生,流动相定容,经液相色谱分离得出的标准色谱分离见图2快三平台官网?;魄苟舅?/span>G1、B1的浓度为50ng/mlG2、B2的浓度为12.5ng/ml。

           2.2 标准曲线及回归方程

              按实验方法进行测定,4种黄曲霉毒素的标准曲线、回归方程及检出限(按3倍信噪比计算)的测定结果见图3和表2快三平台官网。

           2.3 样品的加标回收实验

              取玉米样品一份,分别做两个浓度的加标回收实验快三平台官网。具体做法是:取8ml黄曲霉素空白样的提取液,分别加10μl 25μl黄曲霉素混合标准液(1 000ng/ml黄曲霉素B1、G1以及250ng/ml黄曲霉素B2、G2)作为加标。经过和样品一样的处理,得出其zui后的理论浓度见下式。

              B1、G1浓度:(0.010ml×1 000ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=12.5ng/ml;

          (0.025ml×1 000ng/ml/8ml×(2ml/0.2ml)=31.25ng/ml快三平台官网。

              B2、G2浓渡:

          (0.010ml×250ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=3.125ng/ml;

          0.025ml×250ng/ml/8ml×(2ml/0.2ml)=7.812 5ng/ml快三平台官网。

           2.4 精密度实验

              按实验方法进行样品处理快三平台官网,对同一样品连续测定5次。

           2.5 样品调查

              从市面上抽取10份玉米样品,按此实验方法进行处理快三平台官网,结果为未检出黄曲霉毒素。此方法简便易行、快速准确、灵敏度高、检测限低,适合大批量检测,值得推广

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